Diplômé de Princeton, il poursuit son parcours universitaire à Yale, où il étudie la littérature anglaise. Plutôt que de poursuivre dans cette voie prestigieuse, David Duchovny préfère alors tout arrêter pour devenir acteur : il commence à tourner dans une pub pour de la bière puis dans des films érotiques à petit budget. Il trouve son premier rôle dans le film Working Girl en 1988, où il joue un jeune fêtard. On le retrouve ensuite dans New Year's Day de Henry Jaglom, puis dans Julia has two lovers de Bashar Shbib. Il apparaît aussi dans la série télé Twin Peaks en travesti. Ce n'est qu'avec ses prochains rôles qu'il tourne enfin dans des films plus sérieux, tels que Chaplin & Ruby, The Rapture ou Kalifornia, aux côtés de Brad Pitt. Mais le rôle qui marque véritablement l'explosion de sa carrière et le consacre en star internationale est celui de Fox Mulder, agent spécial du FBI affecté aux affaires non-classées dans la série fantastique The X-Files.

Le 5 mai 1997, David Duchovny épouse Téa Leoni, actrice de sitcom. Il quitte la série X-Files en 2000. On l'a vu ensuite dans le film experimental de Steven Soderbergh, Full frontal, en 2002, puis dans Evolution.

Il fait son retour à la télévision en 2007 dans la sitcom trash de Showtime Californication.

Agent du FBI dans les Affaires non classées, il est considéré comme marginal. Il travaille dés 1992 avec l\'agent Dana Scully. Il est persuadé que sa soeur a été enlevé par des extraterrestres en 1973. Au fil des saisons, Mulder va comprendre que sa quête de vérité le dépasse ...